摘 要:为适应大规模生产的需要,用Millipore 293 型滤器取代常用的赛氏滤器对重组干扰素α1b及γ进行除菌过滤,此种大型滤器不仅滤膜面积大,而且单位面积过滤量也有明显增加,因此,过滤速度显著加快,可适应大规模生产的应用。用此二种滤器作除菌过滤对干扰素活性无影响,过滤制品前用2 %白蛋白预滤可减少滤膜吸附干扰素作用,Millipore 和赛氏滤器除菌过滤后热原质均能达到肌肉注射标准,且大部分能达到静脉注射标准,有个别制品用赛氏滤器过滤后热原质达不到静脉注射标准者,用Millipore 滤器复滤后,可以合格。上述结果表明用Milli2pore293 型滤器制备重组干扰素α1b及γ是切实可行的。
关键词:Millipore293 型滤器; 除菌过滤; 重组人干扰素α1b ; 重组人干扰素γ
除菌过滤技术是生物制品生产中的常用方法,特别是基因重组制品生产时,要达到无菌要求必须进行除菌过滤,我所生产的重组人干扰素α1b和γ由于社会需求的增加,产量逐步扩大,过去在原液稀释后用赛氏滤器作除菌过滤制备半成品的方法已不适用于大规模生产,因此必须对除菌过滤的方法进行改进,用一种既能保证产品质量,又能大幅度提高生产效率的滤器来替代原用的赛氏滤器,本文报告Millipore 293 大型滤器在重组人干扰素α1b和γ除菌过滤中应用的情况。
材料和方法
1 滤器
Millipore 293 滤器由爱尔兰公司出品,简称大滤器,滤器Φ= 33cm 滤膜为爱尔兰公司出品Φ=30cm ,截流孔径为0.22μm ,预滤膜爱尔兰公司出品Φ= 26cm ,其有效过滤面积为707cm2 。
赛氏滤器为上海医工院出品,简称小滤器,滤器Φ= 18. 3cm ,滤膜Φ= 1515cm ,截流孔径为0.22 μ,有效过滤面积为188 cm2 。
2 灭菌方法
大小滤器均先将主件及配件洗净,经180 ℃干烤2 h ,装入滤网,滤膜,预滤膜经0. 105 mPa 60 min高压灭菌后备用。
3 制品
本所生产的重组人干扰素α1b和γ原液。
4 稀释和除菌过滤
4.1 溶液的配制
用无菌无热原的注射用水配制0.85 %氯化钠溶液,经超滤器超滤,滤膜截流孔径为0.22 μm ,超滤后4 小时经0. 06 mPa 30min 灭菌,后取样作鲎试剂测定,合格后方可用于生产。
4.2 稀释
于0.85 %氯化钠溶液中加入检定合格,其中包括热原合格的20 %的人白蛋白,配制成2 %人白蛋白生理盐水稀释液,取原液按生物活性释液至所要求的规格。
4.3 除菌过滤
用Millipore 293 大型滤器和赛氏小滤器对重组人干扰素α1b和γ进行除菌过滤,过滤后取样作效价测定,热原质试验及无菌试验。
5 热原试验方法
用家兔法按1995 版中国生物制品规程的要求进行〔1〕。
6 干扰素的效价测定方法:
用WISH/ VSV 系统,用国家标准品换算为国际单位( IU)〔1〕。
7 无菌试验方法
按1995 版中国生物制品规程的要求进行〔1〕。
结 果
1 不同滤器的过滤量和速度比较:
分别用小滤器和大滤器过滤重组人干扰素α1b和γ的结果见表1 。
从表1 可见: 小滤膜平均每张滤膜滤过量为5008 ml ,大滤膜平均每张膜滤过滤量为47497 ml ,平均每张大滤膜滤过量为小滤膜的9.5 倍,大滤器的面积为小滤器的3.75 倍,小滤膜平均每cm2 滤过量为26.7 ml , 大滤膜平均每cm2 滤过量为67.2ml ,即大滤器为小滤器的2.5 倍,用每张小滤膜过滤一批5000 ml 左右的制品平均过滤时间为103 min ,而大滤器过滤将近40000 ml 左右的制品平均过滤时间为123 min。每分钟单位面积通过的毫升数平均由0.26 ml/ cm2·min 增加到0.55 ml/ cm2·min 即大滤器平均比小滤器提高1 倍以上。表明除菌过滤速度的加快,不仅是滤膜面积的扩大,而且效率也有明显的提高。
2 用2 %白蛋白预滤的作用:
当滤器扩大后,滤膜面积明显扩大,为避免滤膜对制品的非特异性吸附,我们在过滤重组干扰素α1b30μg 时先用2000 ml 2 %白蛋白稀释液进行预滤,并与未作预滤过滤重组10 μg 规格干扰素α1b作比较,其结果见表2 。
从表2 可见:除菌前不用2 %白蛋白稀释液充分吸附滤膜,由于滤器的滤膜及预滤膜的吸附作用,而使干扰素半成品数损失180～200 ml 左右,并使干扰素效价下降1.0～1.3 ×104 IU/ ml 左右,而过滤前用2 %白蛋白稀释液先作过滤,使滤膜充分吸附稀释液,则干扰素过滤后总液量没有损失,且效价损失仅为0.5～0. 6 ×104 IU/ ml ,比未吸附者为少。
3 不同规格滤器过滤后对干扰素活性的影响:
检定合格的纯化干扰素原液,按生物学活性用2 %白蛋白生理盐水稀释至一定效价。然后作除菌过滤,过滤前后取样测定效价,以观察通过不同滤器过滤后对干扰素活性是否有影响,结果见表3 。
从表3 可见,无论是重组人干扰素α1b还是γ,经大小滤器除菌过滤后,效价与未过滤前相似,证明用二种滤器除菌过滤α1b及γ干扰素,对干扰素最终效价无影响。
4 二种滤器除菌过滤后,制品热原质情况结果见表4。
表4 中所列热原质系3 只家兔升温的平均数,无论是用大滤器还是用小滤器除菌过滤,最终热原均合格。表明用大滤器进行除菌过滤对制品热原无影响。
5 热原偏高制品用大小滤器重滤的结果:
重组干扰素系肌肉注射制品,过去热原按肌肉注射标准判定,但为进一步提高制品质量,现在改用按静脉注射标准判定,要求提高后,有少数批未达到静脉注射热原合格标准,但达到肌注热原合格标准,再用大或小滤器重滤一次,滤后测定热原质的情况,结果见表5 。
从表5 可见:二批重组干扰素α1b第一次热原试验未达到静脉注射标准,即三只兔体温总和超过1.4 ℃或其中一只兔升温超过0.6 ℃,经小滤器重滤后,热原仍未达到静脉注射标准,而另二批重组干扰素α1b第一次热原试验未达到静脉注射标准者,其情况与上述小滤器重滤者相似,经大滤器重滤后,热原均达到静脉注射标准,上述结果初步表明,使用大滤器后,使重组干扰素的合格率有所提高。
6 无菌试验:
用大滤器作除菌过滤迄今已制备半成品约350批,按规程要求进行无菌试验,无菌试验全部合格,证明大滤器除菌效果良好,制品质量有保证。
讨 论
从本文的结果可见,用Millipore 293 型滤器制备重组人干扰素α1b和γ是切实可行的,其优点为,不仅滤膜面积增大且单位面积滤过的毫升数也增加,同样一张过滤膜,大滤膜的滤量是小滤膜的九倍以上,且大滤膜的质量好,其膜厚薄均匀,具韧性、不易破损、使用方便、不易阻塞,故每次50000 ml 半成品一次过滤即可完成,使工作效率明显提高在膜的处理方法上,大滤膜也较小滤膜简单,生产至今,大滤膜完全能保证重组人干扰素α1b和γ的质量,经除菌过滤后,效价、无菌试验、热原质测定均达到重组人干扰素α1b和γ的质量要求,当然它也存在缺点,即滤膜及预滤膜均是从国外进口,价格上较小滤膜贵,但在大规模生产和提高生产效率上的作用是显易而见的。
随着生产任务的加大和市场需求量的增加,扩大过滤技术在重组人α1b和γ干扰素生产中起着重要的作用。
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