无菌过滤系统完整性测试方法探讨-上海联兵环保免费电话：400-600-5030

 摘要：通过对完整性测试原理的探讨，各种完整性测试操作方法及其适用性的研究，对企业提出一些操作性建议。结论：完整性测试对无菌过滤系统非常重要，企业需要在对各种测试方法深刻了解的基础上选择合适的方法进行测试，以提高完整性测试水平。
    关键词：完整性测试；起泡点测试；扩散流测试；HydroCorr测试
    1·概述
    1.1无菌过滤概述
    无菌产品制造分为两类：第一类是产品最终灭菌型，第二类是非最终灭菌型。无菌制剂的灭菌是整个产品在生产过程中的关键，对于热敏性程度比较高的药品，由于不能进行热力灭菌而大多采用无菌过滤的方法进行微生物的滤除。在无菌过滤过程中，过滤器是工艺中最关键的组件之一，它和终端灭菌工艺中的灭菌釜同样重要，为最终产品提供无菌保障。无菌过滤的效果取决于过滤器的特性和完整性测试的效果［1-2］。完整性测试是保证无菌过滤系统有效的必需手段，也在法规中作了明确要求。
    1.2完整性测试概述
    有两个基本的理由需要做完整性测试，需要做一系列测试，例如：确认制造规格、正确的过滤孔径、灭菌前的完整性和蒸汽、消毒灭菌后的完整性等，保证产品达到相应的质量要求，易于被客户接受；另一方面，从法规角度看，过滤是操作的关键步骤，从质量管理的宗旨出发，保证过滤系统的有效性就必须要求进行滤膜的完整性测试。
    1.2.1完整性测试的法规要求
    在制药业中，完整性测试是过滤工艺的必需要求。FDA在无菌产品制造指南（2004）中明确规定：对于由一个或多个滤器组成的过滤系统，对它的验证都应该包括在最差条件下进行的微生物挑战试验和完整性测试。法规除了对完整性测试做了明确规定，对完整性测试的方法也做了相应的要求。
    欧盟对于无菌药品GMP指南的附件一（2008）中规定：即在使用前应该检查除菌过滤器的完整性，并且在使用后应当立即用适当的方法，如气泡点、气散流或压力保持试验等方法进行测试确认。FDA对于无菌操作生产的无菌药品的要求：完整性测试通常在过滤器安装，灭菌后，使用前进行。PDA技术报告26版中介绍：现行的GMP要求过滤器及过滤系统在使用前及使用后均需要进行完整性测试［5］。
    我国药品质量管理规范（2010）附录一“无菌药品”中规定“：除菌过滤器使用后，必须采用适当的方法立即对其完整性进行检查并记录。常用的方法有起泡点试验、扩散流试验或压力保持试验［6］。”法规和质量管理都需要数据来确保可靠和预知过滤器性能。
    1.2.2完整性测试的理论基础
    完整性测试主要是测试滤膜的完整性，过滤的主要原理是通过滤膜来拦截比膜孔大的污染物，虽然过滤效果与滤膜的材质、类型以及所拦截污染物的性质等多因素有关，但滤膜的有效性是先保证其完整性。完整性测试可以分为两类：（1）破坏性试验，主要是微生物挑战测试；（2）非破坏性试验，主要是起泡点试验和扩散流测试。破坏性和非破坏性测试两者的数据必须有关联，进而得到用户的完整性测试的数据，这是法规的要求，也是测试应用的验证理由。
    起泡点和微生物挑战有直接关联，因为起泡点与微生物截留值直接相关，如图1［7］所示。
              
    图1显示了在实际生物制药使用过滤器时微生物截留量与非破坏性起泡点测试的相关性。图上的每个点代表一个单独的过滤器，LRV（log reduction value）为微生物截留值的对数，是微生物挑战的测试结果，Y轴值越大的过滤器有越高的微生物截留量。红色点表示这些过滤器可以保留＞109的微生物，换言之，这些过滤器可以提供无菌滤液，被视为无菌级过滤器。X轴显示了在挑战测试进行前起泡点测试的结果。
    从这张图可以看到微生物挑战与起泡点测试之间有很明确的相关性。当起泡点变高，LRV也变大。Ret［i8］，Elford［9］，Pall和Kirnbauer［10］，以及Leahy和Sullivan［11］的研究也说明了起泡点和微生物截留量之间的关系，如图2［8-11］所示，这样的关联数据可以确定某一特定过滤器在特定过滤工艺中的特性。
               
    起泡点和微生物挑战性测试具有直接相关性，而扩散流测试和微生物挑战则具有间接相关性。扩散流分布取决于扩散流值和微生物截留量两个。静态分析允许我们在扩散流分布图中设置一个标准值，如果有某个滤料的扩散流值低于这个标准值，则在一定程度上可以证明这个滤料可以被保留，如图3［7］所示。
              
    2·完整性测试方法
    非破坏性完整性测试可以根据物理性质不同分为两类，基于毛细管原理的起泡点测试方法，Corrtest测试（水压法）以及Hydrocorr测试（挤水法）为一类；扩散流测试和压力保持测试属于基于Fick定律定义的气体通过液体扩散的原理测试。制药企业可以根据自己的需要选择适合自己工艺和产品的方法进行完整性测试。
    2.1起泡点测试
    起泡点是气体从湿润的最大膜孔压出液体快速流出时的压力。滤膜孔中的液体是气体通过膜孔的障碍，但是，在足够压力的推动下，气体可以挤压出滤膜孔中的液体，这样气体便可以快速地穿过滤膜孔。这个让液体流出膜孔的压力与孔的大小成反比。因此起泡点可以显示过滤结构内保持液体的力大小。这是最传统的非破坏性试验。
    2.1.1起泡点测试方法
    起泡点测试的一般程序［12］包括：（1）用相应的溶剂润湿滤膜，一般亲水性滤膜用纯水润湿，疏水性膜用乙醇/水混合溶液润湿。（2）根据滤芯生产厂家给的资料数据，将系统压力加到预计起泡点压力的80%。（3）慢慢加压直到出现大量连续的起泡。（4）如果起泡点低于标准值，则需要考虑几种情况：1）滤液与推荐的滤液有不一样的表面张力；2）虽然滤膜是完整的，但滤膜孔的大小却不符合原定要求；3）压力太高；4）滤膜在第一步湿润时没有完全润湿；5）滤膜不完整。这些因素可以在起泡点等式中体现。
    2.1.2起泡点测试影响因素和适用性
    起泡点测试公式为：
            
    公式表示了影响起泡点压力的关键参数，表面张力σ是指液体分子之间的相互吸引力。接触角θ是液体分子和膜分子之间的夹角。这两个分子之间相互吸引形成毛细管力提供液体在滤膜孔中的支持力。这种毛细管力与滤膜孔大小成反比，膜孔越小，毛细管力越强，则起泡点越高。形状校正因子k是用来调和理论泡点和实际泡点的差异。由于起泡点等式是在完美圆形孔的基础上形成的，但真实的滤膜孔有各种形状，所以在计算时，对于不规则膜孔需要用形状校正因子来校正。在注意这些流体的不变量的同时，如粘度、密度、流体特性等，还要注意到，在这些不变量中没有关于气体的性质参数。尽管起泡点测试不依赖于气体性质，但不同的气体对于起泡点测试的精确度却有很大的影响。例如，如果用高溶解度的气体（CO）2，它在溶液中高度溶解扩散，这就会很难区分扩散流和起泡点流体。这种起泡点测试主要用于对在线蒸汽灭菌后、过滤使用前的对亲水性产品过滤器的完整性测试。手动测试通常适用于过滤器面积小于2 000 cm2，自动完整性测试仪适用于气体流速超过100 mL/min或自动测试仪的限定。但这种方法对于大面积滤膜的测试有所限制。
    2.2扩散流测试
    在大于起泡点压力作用下，气体流可以非常迅速地穿过滤膜孔，这在实验室可以明显观察到。而在压力小于起泡点压力时，事实上，有非常小的气体流在滤膜孔中的液体间进行扩散。这个气体流是由于过滤滤膜两边的压力差或压力梯度而形成的，即膜压差造成跨膜气体浓度差。因为当滤液完全润湿滤膜，在过滤器上游通气体后，过滤器上游的气体分子比下游要多，为了保持平衡，过滤膜上游的气体分子将会溶解到滤膜孔中的液体中，然后在过滤器中扩散直到到达过滤滤膜的下游端，结果使膜孔溶解的气体流出。这种气体流就叫做扩散流。需要明确，只有在滤膜孔液体中的气流才是扩散流。
    2.2.1扩散流测试方法
    一般在做完整性测试时，上游压力控制在泡点值的80%，这时，下游气流应小于规定值。若滤膜出现破损，则这时在80%泡点值的压力下，会扩散更多气体使得下游气流大于规定值。
    扩散流测试程序［12］：（1）用合适的滤液完全润湿滤膜，亲水性滤膜可以用水溶液润湿，亲油性滤膜用水/乙醇混合溶液润湿。（2）慢慢增加滤膜上游的压力到推荐起泡点的80%为宜。（3）等待系统平衡后，用流量计或者倒置的量筒测量气体流量1 min。（4）如果扩散流高于标准值，需要考虑几种情况：1）滤膜孔径是否正确；2）温度比周围环境温度高；3）滤膜没有完全润湿；4）滤膜不完整；5）液体、气体混合比例不符合推荐液气混合比；6）稳定时间不够。
    2.2.2扩散流测试影响因素和适用性
    扩散流等式为：
                
    从公式可以看出，扩散流取决于特定的几个变量。
    （1）扩散因子K决定了测试气体在液体中的溶解度以及在液体中扩散的速度。因此在做扩散流测试时，既需要考虑测试气体也需要考虑过滤液体，不同的气体在不同的液体中都会有不同的扩散因子。（2）压力P1、P2的影响，扩散流与压力有直接关联，扩散流在40 psi时会比在20 psi时高两倍。（3）滤膜开孔率P，膜孔越多，则气体流越高，这对于膜面积也同样适用。（4）有效膜孔长度L的影响，在这里也就是膜的厚度。
    扩散流测试主要用于在膜面积较大的情形下。在膜面积较小时，起泡点测试的结果就可以为完整性测试做出客观判断，这时不需要做扩散流测试，因为扩散流值非常低，不容易测量，而起泡点值由于其“连续不断的气泡出现”的现象则很容易判断。在膜面积较大时，需要尽可能多关于膜的信息，可以使用起泡点和扩散测试相结合的方式。判断是起泡点还是扩散流非常重要，手动测试起泡点是基于实际测量的气体流量，扩散是基于定量测量的气体流量。气体流速越大越难分辨起泡点和扩散流，推荐过滤器流速＞100 mL/min的情况下运用扩散流测试法。同时考虑到扩散流测试的影响因素，扩散流测试也更适用于大而薄的滤膜和有机溶剂润湿过的滤膜。
    2.3 HydroCorr专用测试
    HydroCorr测试是密理博公司开发的一种完整性测试方法，又叫做水挤压法测试。HydroCorr测试主要用于疏水性膜的完整性测试。它是基于水在疏水性滤膜表面存在表面张力和毛细管现象发展出来的。
    HydroCorr是一种高度灵敏，不用醇类而根据水流量进行疏水性滤膜完整性测试的方法。在测试过程中，把水压进最大的膜孔所需要的最小压力称为水侵入压。进行测试时的压力低于水侵入压，压力维持但不再加压。对于一个完整的过滤器，水将难以进入滤膜而不会导致下游的污染。在HydroCorr测试过程中测定的是折叠过滤器结构尺寸上被挤压而产生的水流量，这不会对过滤器造成损坏。同时，由于滤膜没被润湿，所以只需要稍许干燥或不需要干燥，可以在完整性测试完后很快或马上投入使用。
    HydroCorr的专用测试适用于疏水型呼吸过滤器SIP以后过滤前的完整性测试。此种测试是在呼吸过滤器的上部而不要求在其下部进行操作，因而完全适用于对过滤器的完整性评价及SIP的在线灭菌过程，且不致损坏呼吸过滤器。
    3·完整性测试失败处理措施
    企业在进行完整性测试时，一种是在过滤器使用前的完整性测试，一种是在使用后的完整性测试。在做使用前的完整性测试时，如果测试失败，但测试值与标准值只有较小差距，这时可以再次湿润过滤器，使用两倍于初次湿润压（或者冲洗量，浸泡时间）或者在过滤器两边使用高压差的方法重新测试，看过滤器是否通过测试，如果可以通过，则记录数值和程序；若不通过，则需要对过滤器的完整性进行重新评估。如果测试结果与标准值差距较大，在能够更换滤芯的情况下，可以更换新的滤芯重新测试；若不能更换，则提高测试条件重新测试评估。其步骤如图4所示。
               
    如果是在使用后进行完整性测试，这时测试结果与冲洗量和浸泡时间有很大关系，在失败后，可以用两倍的冲洗量或者浸泡时间进行再次测试，对测试结果进行评估，若与标准值有很大差距，可以用70/30异乙醇润湿，再次检测。
    浸润与测试结果关系密切，因此，再次浸润时注意运用不同的操作条件来达到相关要求，例如，使用更长时间润湿，使用更高的压力润湿，更高的温度润湿或者用动态冲洗取代静态浸透的方法都是可取的。
    完整性测试结果与环境、温度、操作条件有很大关系，在测试失败后需要依据相应的SOP做出合适的处理措施，以最高的效率保证过滤效果。
    4·结语
    起泡点测试、扩散流测试和HydroCorr测试是法规认可的完整性测试方法，对于不同方法的选择依赖于测试装置，由于过滤器制造商、公司体系和测试环境的不同，企业需要根据自身的实际情况以及各种方法的适用性来选择自己的方法。

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